Rapport d'activité 2008 - LIEBE

Contribution 2008 au GIS
Nom	Statut	ETP
Paule Vasseur	PR	30 %
Pascale Bauda	PR	10 %
Jaïro Falla	PR	10 %
Jean-François Férard	PR	5 %
Pascal Poupin	MCF	30 %
Philippe Laval-Gilly	MCF	20 %
Jean-François Masfaraud	MCF	20 %
Sylvie Cotelle	MCF	10 %
Claudine Rast	IR	40 %
Marie-Andrée Dollard	AI	50 %
Eric Béraud		10 %
Asma Rokbani Achour	thèse soutenue en 2008	100 %
Marc Dazy	thèse soutenue en 2008	100 %
Chantal Fouque	Technicien	40 %
Anne-Marie Veber	Technicien contractuelle	40 %
Didier Techer	Doctorant	100 %
Claudia Patricia Martinez-Choiz	Doctorant	100 %
Audrey Cordy	Doctorant	100 %
Marc Bonnard	Doctorant	100 %
Anne-Sophie Foltete	Doctorant	50 %

Objectifs de l’année 2008 dans le cadre du GISFI

Trois thèmes de recherche sont abordés par l’UMR 7146 LIEBE. Pour chacun d’eux, les objectifs 2008 étaient les suivants :

Thème 1 : Microorganismes des sols pollués : mécanismes de résistance, processus métaboliques

• Etude génétique du mécanisme de résistance à l’arsenic d’un isolat de Microbacterium sp provenant d’un sol contenant de l’arsenic : analyse fonctionnelle de l’opéron de résistance mis en évidence en 2007.
• Etude du métabolisme bactérien de l’arsenic sur le site de Sainte Marie aux Mines : isolement des bactéries résistantes et caractérisation taxonomique, analyse de la diversité totale à partir du sédiment prélevé en aval de la mine d’arsenic de Gabegotte.
• Analyse de la composition et de l’activité d’un consortium bactérien performant dans la biodégradation des HAPs

Thème 2 : Evaluation de la fonction d’habitat des sols pollués

• Etudier la recolonisation par les plantes de sols pollués et mettre en relation les aptitudes de recolonisation de certaines espèces avec leurs capacités de défense cellulaire.
• Evaluer l’écotoxicité et la génotoxicité du sol des parcelles du site d’Homécourt et des percolats recueillis en 2008. Etudier les relations entre biodisponibilité, écotoxicité et génotoxicité de sols contaminés par les HAP et les métaux.

Thème 3 : Biorémédiation des sols contaminés par les HAPs par biodégradation bactérienne couplée à la phytorémédiation par Miscanthus X giganteus (MxG)

Etude de la décontamination des sols contaminés par les HAP par phytorémédiation à l’aide de Miscanthus X giganteus. Evaluation des échanges moléculaires entre le sol et les rhizomes de MxG et influence des exsudats racinaires (acides aminés, acides organiques, sucres…) sur la biomasse bactérienne, en vue de la valorisation des sols de friches industrielles contaminées en Lorraine.

Principaux résultats

Thème 1 : Microorganismes des sols pollués : mécanismes de résistance, processus métaboliques

• Analyse fonctionnelle des gènes impliqués dans la résistance à l’arsenic chez Microbacterium sp. par l’analyse de mutants.

Constitution d’une collection de 229 isolats résistant à l’arsenic à partir du sédiment en aval de la mine d’arsenic de Gabegotte en cours de caractérisation, création d’une banque de clone construite par clonage des produits de PCR obtenus avec des amorces universelles 16S. Cette banque est en cours d’analyse.

• Analyse taxonomique d’un consortium performant dans la biodégradation des HAPs.

Thème 2 : Evaluation de la fonction d’habitat des sols pollués

• Etude de la recolonisation par les plantes de sols pollués et mesure de leurs défenses cellulaires.

Après deux années de colonisation, 49 espèces ont été identifiées dans la zone témoin (4 x 6 m2) et 41 dans les parcelles (4 x 6 m2) contenant la terre de Neuves-Maisons. Au vu des résultats antérieurs (rapport d’activité 2007), les communautés végétales se sont diversifiées sur les deux types de sol et l’écart noté alors (35 et 15 espèces sur les zones « témoins » et « sol pollué » respectivement) tend à diminuer.

Figure 21. Proportions (en %) des familles végétales observées au sein des communautés de la zone témoin (A) et des parcelles (B) après deux années de colonisation.

L’indice de similitude de Sorensen entre les deux listes d’espèces atteint 0,53. Les indices écologiques descripteurs des communautés ont été déterminés par parcelle, définissant 4 replicats pour les conditions « témoin » et « sol pollué », étudiées statistiquement.

Tableau 4 : Indices écologiques concernant les communautés végétales établies sur zone témoin et sur sol pollué après deux années de colonisation. * : différence statistiquement significative (p<5%, test U de Mann-Whitney)

Les richesses spécifiques différent notablement entre les deux conditions « témoin » et « sol pollué » pour laquelle la valeur de S est significativement plus faible (-30% par rapport au témoin). L’indice de diversité H’ traduit cet écart également. Toutefois, en terme d’équitabilité, les communautés végétales des deux conditions sont proches l’une de l’autre. Les niveaux des activités enzymatiques anti-oxydantes et la concentration en MDA ont été mesurés dans les feuilles des 3 espèces déjà étudiées lors de la dernière campagne : Erigeron canadensis, Matricaria recutita (ex chamomilla) et Oenothera biennis.

Figure 22. Réponses biochimiques mesurées dans les feuilles des individus de trois espèces aptes à s’implanter naturellement dans les parcelles. Les effets significatifs par rapport aux réponses des zones témoins sont mises en évidence par des étoiles Dunnett’s test (n = 7; * p<0.05; ** p<0.01).

E. canadensis présente une croissance moindre (env.-20%, résultat non illustré) en condition « sol pollué » qu’en condition « témoin ». Les activités enzymatiques sont toujours plus importantes chez les individus issus du sol pollué. Toutefois, pour seulement 3 des 5 activités l’écart est significatif (APX, GPX, GRD). Le MDA n’apparait pas affecté par l’exposition au sol pollué. Lors de la campagne précédente, toutes les activités enzymatiques ainsi que la teneur en MDA étaient significativement plus élevés en condition « sol pollué ». La croissance de M. recutita est paradoxalement plus importante en condition « sol pollué » (+10-20% environ). Les niveaux d’activités sont supérieurs en condition « sol pollués » mais l’écart est faible et non significatif pour 4 des 5 activités (seule la SOD se distingue), ce qui n’était pas le cas antérieurement. De plus, les taux de MDA sont identiques pour les deux lots expérimentaux, résultat déjà noté l’année précédente. Enfin, pour O. biennis, une croissance moindre en condition « sol pollué » est notée (–20-30% environ). Les niveaux d’activité enzymatiques sont significativement différents entre les deux conditions : pour les individus issus du sol pollué, les activités sont soit plus élevées (SOD, CAT, GPX), soit plus faibles (APX, GRD) que pour ceux de la zone témoin. Comparativement aux résultats antérieurs, les taux d’induction (SOD, CAT) et d’inhibition (APX, GRD) sont moindres et une activité, la GPX, est passée d’un niveau d’activité inhibé à induit. Comme l’an passé, la concentration en MDA est significativement plus élevée chez les plantes exposées au sol pollué.

Les résultats confirment les observations antérieures : les plantes issues des parcelles « sol pollué » expriment des défenses anti-oxydantes. Toutefois plusieurs différences doivent être notées. Les défenses anti-oxydantes semblent moins sollicitées qu’auparavant, ce qui se traduit globalement par des taux d’induction moindres ou un nombre d’activités significativement induites plus faible. De plus, une diminution des taux d’inhibition des activités APX, GPX, GRD chez O. biennis et un taux de MDA non augmenté chez E. canadensis exposé au sol pollué constituent des changements qui pourraient attester d’une moindre sensibilité des individus prélevés en 2007, ou bien d’une évolution de la biodisponibilité des toxiques dans la terre polluée de Neuves-Maisons.

• Evaluation de l’écotoxicité et la génotoxicité du sol des parcelles du site d’Homécourt et des percolats recueillis en 2008. Etude des relations entre biodisponibilité, écotoxicité et génotoxicité de sols contaminés par les HAP et les métaux.

Ecotoxicité et mutagénécité des percolats des parcelles
Aucune toxicité aiguë des percolats n’avait été notée avec les tests Microtox et daphnies (24-48h) au cours des campagnes de prélèvements antérieures. Les essais d’inhibition de la croissance des populations algales Pseudokirchneriella subcapitata et les essais de reproduction des invertébrés Ceriodaphnia dubia avaient par contre révélé une toxicité élevée des percolats des parcelles de sol NM. Les résultats obtenus au cours des campagnes de prélèvement en 2008 ont apporté des résultats équivalents :

• • les concentrations de percolats inhibant 50% de la croissance algale après 72h d’exposition (CE50-72h) se situent entre 0.2 et 1.7% selon les échantillons. Il apparaît toutefois que la toxicité est légèrement plus élevée sur les percolats des terres non végétalisées (terre nue, parcelles ensemencées par Thlaspi). La toxicité algale est la plus faible pour les percolats des parcelles végétalisées par la luzerne Medicago sativa.
  • les concentrations de percolats qui inhibent 50% de la reproduction des invertébrés après 7 jours d’exposition sont comprises entre 0.1 et 1%. Il n’est pas observé de différence en fonction de la présence ou non d’un couvert végétal.

En ce qui concerne les parcelles du sol thermodésorbé TD, la toxicité sur les algues est nettement plus faible que pour le sol NM, avec une CE50 de l’ordre de 50%. Par contre, la toxicité des percolats TD reste élevée sur les Cériodaphnies (CE50 de 0.6 à 3%), bien qu’inférieure à celle des percolats NM. Les essais de mutagénicité effectués avec le test Umu sur Salmonella typhimurium his- TA1535/pSK1002 (ISO 13829, 2000) sont restés négatifs, qu’ils aient été réalisés avec et sans activation métabolique. Les résultats obtenus avec Salmonella typhimurium his- testés selon le test d’Ames en milieu liquide - test de fluctuation - plus sensible que le test Umu donnent des résultats positifs avec la souche TA98. La positivité est plus marquée sans activation métabolique, qu’avec activation (par ajout du mélange S9 mix contenant les enzymes de biotransformation des xénobiotiques). Ces résultats peuvent cependant être discutés compte tenu d’une interférence possible liée à la précipitation se produisant lors de l’ajout de l’échantillon au milieu test. Ce type de résultats est récurrent depuis le début des essais et demandera à être élucidé en testant des fractions purifiées des percolats ou des extraits organiques plutôt que les percolats bruts. La toxicité des percolats sur algues et ceriodaphnies n’est pas expliquée par la richesse en sulfates et en sels des percolats. En effet, des essais complémentaires ont été réalisés sur ces éléments, lesquels se sont révélés sans toxicité sur les algues aux concentrations mesurées dans les percolats. La photooxydation des hydrocarbures présents dans les percolats n’explique pas non plus la toxicité, ainsi que l’ont montré les essais des percolats sur Ceriodaphnia dubia réalisés à la lumière ou à l’obscurité.

Toxicité et génotoxicité du sol des parcelles
Aucune différence de toxicité en fonction du traitement des parcelles n’a été notée avec les sols NM et NMDT sur vers de terre et collemboles. Les sols NM et NMDT n’ont pas affecté la survie des vers de terre Eisenia fetida adultes après une exposition de 14 jours selon le protocole normalisé ISO (11268-1 1994). Une inhibition de la reproduction, faible mais significative, a cependant été constatée ; la reproduction a été évaluée par la production de cocons après 28 jours et la production des juvéniles après 56 jours (ISO 11268-2, 1998). L’inhibition est de l’ordre de 30 % pour les cocons et de 40% pour les juvéniles avec les échantillons de sols NM et NMDT testés bruts (sans dilution par un sol témoin). Des effets génotoxiques ont été observés sur les coelomocytes d’Eisenia fetida exposés aux sols NM et NMDT aux concentrations de 50% et 75% des échantillons de sol. La génotoxicité a été évaluée par le test des comètes après 4 et 10 jours d’exposition des vers de terre. De façon surprenante, le sol thermodésorbé s’est avéré plus génotoxique sur les vers de terre que le sol non traité. Les sols NM et NMDT se différencient par leur teneur en HAPs, nettement plus élevée dans le sol non traité (NM) que le sol thermodésorbé (NMDT). La contamination par les HAP peut être invoquée pour expliquer la génotoxicité du sol NM, mais elle est moins plausible pour le sol thermodésorbé. La génotoxicité du sol thermodésorbé ne peut être imputée aux HAP, mais aux métaux. La contamination par le cadmium, le nickel et le chrome peut être mise en cause dans les deux types de sol. L’hypothèse que la thermodésorption des sols modifierait voire augmenterait la biodisponibilité des polluants métalliques vis-à-vis des vers de terre et ainsi leur toxicité peut être posée.

Relations entre biodisponibilité des HAP et des métaux, et génotoxicité de sols
Les essais de génotoxicité à court terme (10 jours) sur les cœlomocytes de ver de terre exposés aux sols contaminés par les HAP et les métaux montrent que les dommages à l’ADN sont un marqueur d’exposition précoce aux polluants génotoxiques et un indicateur de leur biodisponibilité. Les critères génotoxicité et inhibition de la reproduction ont une sensibilité équivalente. Des résultats analogues ont été obtenus dans le cas du sol de la cokerie d’Homécourt, la génotoxicité se révélant aux mêmes concentrations que l’inhibition des critères de reproduction.

Fig. 23 : Comparaison des résultats de génotoxicité (a) et des effets de toxicité sur la reproduction (b) des vers de terre Eisenia fetida exposés à différentes concentrations du sol d’Homécourt contaminé par les HAP et les métaux. Le sol a été étudié aux concentrations de 10, 20 et 40% dans le milieu ISO. Ces concentrations ont été choisies du fait de la mortalité des vers à la concentration de 75%, aucun animal ne survivant dans le sol pur (100%). La génotoxicité est mesurée sur les coelomocytes par le test des comètes après 4 et 10 jours d’exposition des vers de terre aux milieux tests. Les effets sur la reproduction ont été mesurés après 28 et 56 jours d’exposition selon la norme ISO (11268-2, 1998).

Thème 3 : Biorémédiation des sols contaminés par les HAPs par biodégradation bactérienne couplée à la phytorémédiation par Miscanthus X giganteus (MxG)

La capacité de Miscanthus X giganteus à croître sur des sols de friches industrielles a été déterminée en microcosme et des parcelles ont été réalisées sur des sites industriels. Les exsudats des Miscanthus X giganteus ont été collectés et partiellement analysés. Par ailleurs, leur influence sur la biomasse dégradante a été mesurée.

Perspectives

Thème 1 : Microorganismes des sols pollués : mécanismes de résistance, processus métaboliques

Sur le site de Sainte Marie aux Mines, analyse de la diversité taxonomique et de la diversité des gènes impliqués dans le métabolisme de l’arsenic à partir des bactéries cultivables et des bactéries totales. Analyse fonctionnelle du consortium biodégradeur de HAPs par une approche biopuce fonctionnelle et des métabolites produits.

Thème 2 : Evaluation de la fonction d’habitat des sols pollués

• Etude de la recolonisation par les plantes de sols pollués et mesure de leurs défenses cellulaires.

Les recherches prévues en 2009 porteront sur le suivi des parcelles « Végétation Spontanée » pour compléter les observations faites les années précédentes et commencer à proposer un schéma d’évolution temporel. Par ailleurs, des travaux seront initiés sur la partie Est de la friche, non remaniée depuis le démantèlement de la cokerie et où prolifère la végétation. Ils viseront à décrire les communautés végétales et à étudier différentes populations de solidage, espèce invasive présente sur le site.

• Evaluation de l’écotoxicité et la génotoxicité du sol des parcelles du site d’Homécourt et des percolats recueillis en 2008. Etude des relations entre biodisponibilité, écotoxicité et génotoxicité de sols contaminés par les HAP et les métaux.

Les études ultérieures réalisées dans le cadre du programme Multipolsite (ANR) seront orientées sur (i) la compréhension des mécanismes d’écotoxicité et de génotoxicité des polluants du sol de Neuves Maisons non traité ou thermodésorbé, (ii) l’évaluation d’un potentiel toxique sur la santé humaine via l’utilisation de modèles in vitro de cellules de mammifères. L’étude de l’influence des traitements de phytorémédiation sur la toxicité des sols et des percolats sera poursuivie.

Thème 3 : Biorémédiation des sols contaminés par les HAPs par biodégradation bactérienne couplée à la phytorémédiation par Miscanthus X giganteus (MxG)

Analyse des molécules composant les exsudats de Miscanthus X giganteus pour définir leur rôle dans les processus de biodégradation des HAPs. Analyse de la diversité bactérienne totale à partir des sites implantés et analyse de la composition du consortium bactérien impliqué dans la biodégradation des HAPs. Mesure et suivi de l’écotoxicité des sols de friche en fonction de l’évolution de la biodégradation.

Voir aussi

• La page de présentation du laboratoire

Notes